1942年9月，晉西北軍區改為晉綏軍區，賀龍為司令員，關向應為政委，周士第為參謀長，甘泗淇為政治部主任。同年，賀龍任陜甘寧晉綏五省聯防司令員，在延安工作。晉綏軍區軍事工作由周士第主持。

周士第和晉綏軍區領導用3個多月的時間指揮武工隊襲占敵據點50多個，改變了1000多個村莊的面貌，爭取了100多個日偽村政權轉變成為實際上為我方服務的“兩面政權”，摧毀了敵偽村級政權800多個，進一步鞏固擴大了晉綏抗日根據地。

1943年8月，周士第升任晉綏軍區副司令員。這時，正值國民黨頑固派準備掀起第三次反共高潮，抗日根據地面臨著嚴重的威脅。周士第一面在部隊里開展揭露國民黨頑固派破壞團結、發動反共內戰的陰謀活動，一面積極做好日軍秋季“掃蕩”的備戰工作。

9月1日，日軍五十九旅團、獨立第三混成旅和大批偽軍，瘋狂進犯晉綏抗日根據地。在日偽進攻期間，周士第部署軍區主力部隊分散在各地，一方面協助農民加緊秋收，免遭日偽搶糧；另一方面尋找有利時機，狠狠打擊敵人；并命令各地武工隊和民兵采取“敵進我進”的戰術，趁敵人傾巢而出之際，切斷交通線，襲擊敵據點。在此戰術下，日偽“掃蕩”部隊很快陷入人民戰爭的汪洋大海中，處處被動，疲于奔命。在不斷遭受打擊的情況下，日軍五十九旅團主力被迫退回原據點防守，只留下八十五大隊繼續“掃蕩”。

9月27日，日軍八十五大隊企圖偷襲駐山西興縣的八路軍晉綏軍區機關。周士第得到情報后，迅速率領軍區機關人員掩護群眾轉移，讓敵人撲了空。敵人不甘心失敗，又向興縣周邊其他地區“掃蕩”，并于10月4日奔至黃河東岸的黑峪口，開炮轟擊八路軍一二跂師駐盤塘的河防部隊，被八路軍擊退。當天傍晚，日軍八十五大隊又竄至趙家川口村。

周士第從得到的情報綜合判斷：雖然敵人武器先進，且有飛機隨時支援，但士氣低落。我軍完全可集中兵力，殲滅這股孤軍深入的敵人。

經過充分研究討論后，周士第將他的作戰計劃迅速報告給中共中央晉綏分局和賀龍。分局和賀龍當即批示同意。周士第和八路軍晉綏軍區領導決定：在這股日偽軍撤退時，集中近7個團的優勢兵力，在民兵、游擊隊的配合下，采取沿途分段伏擊、逐步消耗的策略，在運動戰中最終全殲這股敵人。

10月5日，這股日偽軍由趙家川口出發，行至小善畔村附近，和在高地上的八路軍三個連發生戰斗。八路軍的三個連按照周士第的部署，逐步后撤，誘敵深入，將敵人誘到事前設下的伏擊圈，對敵實行第一次包圍。在民兵和群眾的支援下，八路軍打退了日偽軍在飛機配合下的3次突圍。

戰斗中，周士第見敵人瘋狂炮擊西北，立即判斷敵人想聲東擊西，于是連夜派出部隊急行軍趕到戰場東南，又組成兩個伏擊圈。6月2日夜9時，大股敵人果然向東南突圍，隨后在劉家莊到康寧一帶陷入八路軍的第二次包圍中。

雙方激戰至8日凌晨，日軍開始向南突圍，但逃竄至白文鎮附近，遭民兵阻擊，在周士第指揮下，八路軍各團火速趕到，隨即在花子村附近把敵人第三次包圍起來。戰斗至黃昏時分，日偽殘部東逃至興縣東南20公里的甄家莊，爬上東南的高山固守，被追擊而來的八路軍第四次包圍。敵機前來空投補給，但由于地形所限，補給物資多半不能落到敵人手里，反而被八路軍繳獲。周士第根據戰場形勢判斷：敵人已被消耗過半，但困獸猶斗，為了減少己方的傷亡，決定“網開一面”，在其出逃過程中尋機殲滅敵人。他根據地形，再次準確判斷日軍可能突圍的路線，并立即命令部隊事先沿途設伏，并部署武工隊在周邊破壞公路，騷擾敵據點，使其他敵人無法前來增援。

一切就緒后，周士第命令三面圍攻，僅放開東面誘敵出逃。日偽已連續被八路軍圍攻了三晝夜，見“有機可乘”，立即向東突圍，剛剛逃至鄭家岔喘息的時候，卻發現被團團圍困在山溝里，陷入了八路軍的第五個包圍圈。敵人發動5次突圍，均被擊退。周士第見時機成熟，指揮八路軍、游擊隊、民兵發起全面進攻，戰至11日拂曉，除幾個和部隊走散的敵人逃走外，這股日偽軍被八路軍全殲。

周士第指揮的此次戰斗，創造了八路軍用步槍殲滅陸、空軍配合之敵的戰例。日軍準備進行兩個月的大“掃蕩”計劃，僅40天就被晉綏軍民粉碎。